了解一下腺苷酸環化酶的電鏡酶細胞化學試驗方法

　　下面讓我們一起來了解一下腺苷酸環化酶的電鏡酶細胞化學試驗方法

　　腺苷酸環化酶主要分布于細胞質膜、核膜和內質網膜上。它也是一種磷酸酶，能催化ATP形成3'，5'-環磷酸腺苷(cAMP)并釋放出焦磷酸。

　　Howell等人(1972)首先用亞胺二磷酸腺苷(AMP-PNP)作底物，成功地對動物細胞中的腺苷酸環化酶進行了定位?，F已確認，在未固定和固定的組織中，ATP-PNP是腺苷酸環化酶的專一性底物，在腺苷酸環化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，后者與捕捉鉛離子反應，生成一種不溶性的電子密度很高的產物。但鉛能在一定程度上抑制酶活性，為克服這一缺點， Fujiomto等(1981)設計了使用二鉀亞砜(DMSO)的*法。下面介紹的是Fujimoto等人使用的DMSO的*法。

　　固定:配制固定液的緩沖液使用0.1M pH為7.4的二甲胂酸鈉緩沖液，內含8%蔗糖、5%的DMSO。

　　固定液配方: 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。對于肝臟來說，1%以上的戊二醛固定時，可導致明顯的酶失活。但若加5%的DMSO，酶活性能較好保存?？傮w來說，多聚甲醛與戊二醛的濃度應因組織而異。一般在0~4℃固定2小時或室溫固定1小時。

　　洗滌:用配制固定液相同的緩沖液漂洗1小時~過夜，期間更換緩沖液數次;而后進行厚切片;

　　孵育:配方及條件見\ref,

　　作為腺苷酸環化酶特異底物的AMP-PNP在室溫中或長期冷凍保存時，ATP、AMP-PN 和AMP-PNP-P等化合物容易增多，應引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP-PNP 容易受到組織的堿性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制該酶的活性，在堿性磷酸酶活性高的組織內，左旋咪唑的濃度等因素需特別注意考慮。氟化鈉為腺苷酸環化酶的激活劑，應根據組織不同進行前處理后，將氟化鈉加入到孵育液中。

　　后固定:后固定前，必須用不含DMSO的二甲胂酸鈉緩沖液進行充分洗滌。

　　殘存的DMSO可以與鋨酸反應，產生擴散性的微細顆粒。后固定用二甲胂酸鈉緩沖液配制的1%~2%的鋨酸。鋨酸后固定時對酶反應產物有一定的影響，有人認為固定時間不應超過10min，超過后可引起酶反應產物顆粒變粗變大、擴散，有時由于全部溶出而導致完全沒有反應產物的陰性結果。因此認為用鋨酸固定時間最好控制在5分鐘內。也有用2~4%的戊二醛代替鋨酸進行后固定。

　　對照實驗中可除去底物AMP-PNP，也可在對照實驗的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。